DEVELOPMENT OF FUNCTIONAL PROTEOMICS APPROACHES FOR STUDYING RETROGRADE TRANSPORT

Shi Getao (1)

1 Morphogénèse et Signalisation Cellulaires

Retrograde trafficking allows for proteins transport from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum, via the Golgi apparatus, bypassing the degrading environment of lysosomes. Previous studies have shown that retrograde transport is crucial for cellular functions such as signaling, ion homeostasis, and the establishment of wnt morphogen gradients. Furthermore, retrograde transport plays an essential role in cellular uptake of pathogenic factors like protein toxins and virus proteins. However, the current list of cargo proteins is limited, and it is likely that many cellular functions of retrograde transport still remain to be discovered. Clearly, a strong need exists for further characterization of this transport route. In this study, four different proteomics approaches have been developed aiming to identify membrane proteins taking retrograde transport route: SNAP-tag, sulfation, FKBP, and streptavidin. Amongst these, the SNAP-tag approach turned out to be the most efficient strategy to identify cargo candidates of the retrograde route. This strategy is based on the covalent modification of the plasma membrane proteome with a benzylguanine (BG) derivative. Only BG-tagged plasma membrane proteins that are then transported via the retrograde route can covalently couple to a TGN-localized SNAP-tag fusion protein. The approach was validated step-by-step using a well studied retrograde cargo protein, Shiga toxin B-subunit (STxB). We could show that STxB can be captured and identified by the SNAP-tag approach. Furthermore, coupled with LC-MS, new protein candidates of the retrograde route have been identified. The other three approaches have guided our choice towards the most efficient proteomics strategy, by bringing up experimental opportunities and threats in the fields of organic chemistry and cell biology. Altogether, this thesis work has allowed to develop a novel proteomics strategy that could be applied to identify new cargo candidates of the retrograde route. We have pioneered a dynamic proteomics approach that complements traditional proteomics. Moreover, the concept of using chemical tools to study retrograde transport can also be applied to other endocytic pathways.

Le trafic rétrograde permet le transport des protéines de la membrane plasmique vers le réticulum endoplasmique, via l'appareil de Golgi, évité la dégradation des lysosomes. Des études antérieures ont montré que le transport rétrograde est crucial pour les fonctions cellulaires telles que la signalisation, l'homéostasie ionique, et l'établissement de gradients du morphogène Wnt. Par ailleurs, le transport rétrograde joue un rôle essentiel dans l'internalisation cellulaire des facteurs pathogènes comme les toxines protéiques et les protéines de virus. Toutefois, la liste actuelle des protéines cargos est limitée, et il est probable que de nombreuses fonctions cellulaires du transport rétrograde restent encore à découvrir. De toute évidence, un fort besoin existe pour une caractérisation plus poussée de cette voie de transport. Dans cette étude, quatre différentes approches protéomiques ont été développées visant à identifier les protéines membranaires prenant la route du transport rétrograde: SNAP-tag, sulfatation, la FKBP, et la streptavidine. Parmi ceux-ci, l'approche SNAP-tag s'est avéré être la stratégie la plus efficace pour identifier les candidats du fret de la voie rétrograde. Cette stratégie est basée sur la modification covalente du protéome de la membrane plasmique avec un benzylguanine (BG) dérivés. Seules les protéines membranaires BG-taggées qui sont ensuite transportés par voie rétrograde peuvent coupler covalentement à une protéine de fusion de SNAP-tag localisée dans la TGN. L'approche a été validée, étape par étape, en utilisant une protéine cargo rétrograde bien étudiée, toxine Shiga sous-unité B (STxB). Nous avons pu montrer que les STxB peuvent être capturés et identifiées par l'approche SNAP-tag. Par ailleurs, couplé à la LC-MS, les candidats des nouvelle protéines de la voie rétrograde ont été identifiés. Les trois autres approches ont guidé notre choix vers la stratégie la plus efficace en protéomique, en apportant des possibilités d'expérimentation et de défauts dans les domaines de la chimie organique et en biologie cellulaire. Généralement, ce travail de thèse a permis de développer une nouvelle stratégie protéomique qui pourraient être appliquée pour identifier les nouvelles candidats de la route rétrograde. Nous avons mis au point une approche dynamique en protéomique qui complète la protéomique traditionnelle. Par ailleurs, le concept d'utiliser des outils chimiques pour étudier le transport rétrograde peut également être appliqué à d'autres voies d'endocytose.

Mots clés: Transport rétrograde; la protéomique; SNAP-tag; l'appareil de Golgi

Mots clés: Retrograde transport; Proteomics; Golgi apparatus

Domaines: Biochimie [q-bio.BM]

Shi Getao. DEVELOPMENT OF FUNCTIONAL PROTEOMICS APPROACHES FOR STUDYING RETROGRADE TRANSPORT. Biochemistry [q-bio.BM]. Ecole Normale Supérieure de Paris - ENS Paris, 2011. English. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00635924⟩