RNA Binding Activity of Signal Transduction Proteins in Melanoma
Activité de liaison à l’ARN des protéines de la voie de signalisation MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) dans le mélanome
Résumé
Recent studies have underscored the importance of RNAs in the regulation of protein-protein interactions. By allowing the assembly of protein complexes, non-coding RNAs act as scaffolds and thus promote protein-protein interactions in order to regulate the chromatin state. RNAs are also able to interact with proteins in order to modulate their activities, interactions or localisation. In the cytoplasm, signalling pathways are regulated through a cascade of protein-protein interactions. In the MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) signalling pathway, the binding of a ligand to a membrane receptor triggers a cascade of phosphorylation and protein-protein interactions that allow the transduction of the signal. Abnormal activity of this pathway through increased ligand binding or activating mutations lead to cellular dysfunction associated with tumor initiation and progression.The potential role of RNAs in the direct regulation of protein-protein interactions of key cytoplasmic signal transduction pathways remains largely unknown. The aim of the thesis was to investigate and demonstrate the direct RNA binding activity of proteins involved in the MAPK pathway and to evaluate the role of RNA-protein interactions on intracellular signalling.Using a combination of CLIP (crosslinking and immunoprecipitation) and silica matrix-based affinity capture (2C complex capture) approaches that can uncover direct interactions between proteins and RNAs in vivo, we demonstrated a direct interaction between key MAPK signalling proteins and RNA in melanoma cells. Subsequent microscopy studies using proximity ligation assay (PLA) led us to demonstrate an RNA-dependent modulation of protein-protein interactions in the MAPK pathway, suggesting that an RNA component is involved in the stabilization of these protein-protein interactions. We specifically identified a deletion mutant in BRAF, a central oncogenic protein and therapeutic target in melanoma, that lacks RNA binding activity and harbors decreased signalling activity.By highlighting the existence of an RNA-mediated modulation of protein-protein interactions, this study shows the unprecedented importance of the RNA binding activity of key signal transduction proteins that should be considered in the understanding and targeting of tumor cells.
Des études récentes ont souligné l'importance des ARN dans la régulation des interactions protéine-protéine. En permettant l'assemblage de complexes protéiques nucléaires, les ARN non codants agissent comme des échafaudages et favorisent ainsi les interactions protéine-protéine afin de réguler l'état de la chromatine. Les ARN sont également capables d’interagir avec des protéines pour en moduler leurs activités, leurs interactions ou encore leurs localisations. Cependant, le rôle potentiel des ARN dans la régulation des interactions protéine-protéine dans les principales voies de transduction du signal cytoplasmique reste largement inconnu. L’objectif de la thèse a consisté à rechercher et à mettre en évidence une activité de liaison directe à l’ARN de protéines impliquées dans les voies de transduction du signal cytoplasmique et d’évaluer le rôle des interactions ARN-protéines de transduction sur la signalisation intra-cellulaire. En utilisant des approches de CLIP (CrossLink et ImmunoPrécipitation) et de 2C (Complexe Capture : purification d’ARN basée sur leur affinité pour une matrice de silice), qui peuvent mettre en évidence des interactions directes entre les protéines et les ARN in vivo, nous avons démontré une interaction directe avec l’ARN de certaines protéines clés de la voie de signalisation MAPK. Des approches de microscopie telles que le PLA (Proximity Ligation Assay) nous ont permis de démontrer une modulation des interactions protéine-protéine dépendant de l'ARN dans la voie MAPK, suggérant qu'une composante ARN est impliquée dans la stabilisation de ces interactions protéine-protéine. Nous avons spécifiquement identifié un mutant de délétion BRAF, une protéine oncogène centrale et une cible thérapeutique dans le mélanome, qui montre une déficience dans son activité de liaison à l'ARN, ainsi qu’une activité de signalisation réduite. En mettant en évidence l'existence d'une modulation des interactions protéine-protéine médiée par l'ARN, cette étude démontre l'importance sans précédent de l'activité de liaison à l'ARN des principales protéines de transduction du signal qui devrait être prise en compte dans la compréhension et le ciblage des cellules tumorales.
Origine : Version validée par le jury (STAR)