Diffusion de l'enzyme de restriction EcoRV sur des molécules d'ADN etirées - Université Pierre et Marie Curie Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2005

Diffusion de l'enzyme de restriction EcoRV sur des molécules d'ADN etirées

Aurélien Crut

Résumé

Many proteins have to localize short target sequences on long DNA molecules. The time necessary for the localization is often much shorter than the upper limit estimated for a 3D diffusion process. Several mechanisms have been proposed to account for this extraordinary efficiency (1D diffusion along DNA, jumps...). However, in spite of the large number of studies performed by biochemists in the last twenty years, especially on EcoRI and EcoRV enzymes, a clear conclusion regarding the involved mechanisms has not yet been reached.

In this work, we used fluorescence microscopy to observe the interaction between a single EcoRV enzyme and a DNA molecule. To achieve this aim, we developed a new technique to stretch DNA on a surface, and we labeled EcoRV enzymes with quantum dots, which are very bright dyes that are devoid of photobleaching. The labeled enzymes were still active and could be detected with a spatial resolution close to 10 nm and a temporal resolution of 20 ms.

We observed many association/dissociation events of enzymes on stretched DNA molecules. The analysis of these events allowed us to measure the dissociation rate of the labeled enzymes, and provided evidence for a facilitated diffusion of EcoRV along DNA, whose characteristics could be obtained.
De nombreuses protéines doivent localiser de courtes séquences-cibles sur de longues molécules d'ADN. Le temps nécessaire à cette localisation est souvent beaucoup plus court que celui qui résulterait d'une diffusion 3D des protéines. Plusieurs mécanismes ont été suggérés pour rendre compte de l'efficacité remarquable du processus de localisation (diffusion 1D le long de l'ADN, sauts...). Cependant, malgré les nombreuses études menées par des biochimistes depuis plus de vingt ans, en particulier sur les enzymes de restriction EcoRI et EcoRV, à ce jour aucune expérience n'a pu trancher définitivement entre les différents mécanismes proposés.

Au cours de cette thèse, nous sommes parvenus à observer en microscopie de fluorescence l'interaction entre une enzyme de restriction EcoRV individuelle et une molécule d'ADN. Pour cela, nous avons développé une technique permettant d'étirer les molécules d'ADN au-dessus d'une surface, et nous avons couplé les enzymes EcoRV à des nanocristaux semi-conducteurs, sondes très fluorescentes non sujettes au photoblanchiment. Les enzymes ainsi marquées, toujours actives, sont détectables avec une résolution spatiale de l'ordre de 10 nm et une résolution temporelle de 20 ms.

Nous avons observé de nombreux événements d'association/dissociation d'enzymes sur les molécules d'ADN étirées. L'analyse de ces événements nous a permis de mesurer la constante de dissociation des enzymes couplées, de mettre en évidence une diffusion facilitée d'EcoRV le long de l'ADN et d'estimer les caractéristiques de cette diffusion.
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Dates et versions

tel-00011594 , version 1 (13-02-2006)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00011594 , version 1

Citer

Aurélien Crut. Diffusion de l'enzyme de restriction EcoRV sur des molécules d'ADN etirées. Biophysique [physics.bio-ph]. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2005. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00011594⟩
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