Etude des mécanismes impliqués dans la mise en place et le contrôle de l'expression du gène neurogénine 3 dans le système nerveux central et le pancréas. - Université Pierre et Marie Curie Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2006

Etude des mécanismes impliqués dans la mise en place et le contrôle de l'expression du gène neurogénine 3 dans le système nerveux central et le pancréas.

Résumé

Relax in rats or neurogenin 3 (NGN3) mice is a transcription factor family Basic Helix Loop Helix (bHLH). The expression pattern of this gene during development embryo indicates that it may play a fundamental role in determining the fate nervous and endocrine pancreatic and neuronal precursors, respectively. The first objective of my project is to elucidate the molecular mechanisms to make account of the establishment and control of tissue-restricted expression of the gene NGN3. This study by transgenesis, was made possible by the installation of a laboratory platform transgenesis, which allowed me to generate transgenic mouse models independently. I therefore made different constructs for expressing the β-galactosidase gene under the control elements potentially "enhancer" promoter NGN3. I characterized a factor of 3.85 kb to drive expression of reporter gene exclusively in the territories of expression NGN3 endogenous gene. The study of smaller fragment is ongoing but we have a fragment of 2.2 kb leader in the transgenic lacZ gene expression in the ventral hypothalamus and the pancreatic and intestinal epithelia. The second objective of this thesis is to obtain a marking in vivo by gene transfer of population of stem cells expressing the pancreatic endocrine NGN3 in explants of pancreas embryonic mouse and human. Indeed, we have a unique in vivo system capable to summarize the development of endocrine pancreas by pancreatic xenograft sketches. I demonstrated in this experimental model, the ability of recombinant lentiviruses to infect effectively pancreatic progenitor cells, targeting using specific promoters the reporter gene expression in different cell populations that are differentiated. The construction and production of lentiviral vector to ensure expression of the reporter gene GFP (Green Fluorescent Protein) under the control of the element of 2.2 kb promoter gene NGN3, currently allows transduced explants of embryonic mouse pancreas. Transposition these models of human embryonic tissue is being validated. This work gives us access, in humans, the reservoir of stem cells of the endocrine pancreas. The amplification and selection of such stem cells are a major challenge for the development of new therapies for diabetes type I. The function proendocrine of NGN3 is already clearly established in the pancreas, the third objective is to demonstrate the determination of neuronal function of this factor in the spinal cord. As part of a determination function, the lack of differentiation of a population of neurons is expected following the inactivation of the gene NGN3. We showed that NGN3 null mutation induces ectopic expression of the determination factor Mash1 in the region ventral spinal cord normally expressing NGN3, thereby ensuring compensation functional. To understand the direct determination function and that in NGN3 lack of compensation, we generated mice double mutant Mash1-null NGN3. Phenotypic analysis of loss of function mutants NGN3 and Mash1/ngn3 in the spinal cord ventral allowed us to demonstrate the function of NGN3 in determining neuronal fate. Moreover we have for the first time, established that mature neurons which differentiation is NGN3 are determined by a glutamatergic phenotype. Keywords: NGN3, bHLH, tissue-specific expression, regulatory regions, transgenic embryos and founders, targeting progenitor / stem, gene transfer, functions and proneural proendocrine
Relax chez le rat ou Neurogénine 3 (ngn3) chez la souris est un facteur de transcription de la famille basique Hélice Boucle Hélice (bHLH). Le profil d'expression de ce gène au cours du développement embryonnaire indique qu'il pourrait jouer un rôle fondamental dans la détermination du devenir nerveux ou endocrine des précurseurs neuronaux et pancréatiques respectivement. Le premier objectif de mon projet vise à élucider, les mécanismes moléculaires permettant de rendre compte de la mise en place et du contrôle de l'expression tissulaire restreinte du gène ngn3. Cette étude réalisée par transgenèse, a été possible grâce à l'installation au laboratoire d'une plate-forme de transgenèse, qui m'a permis de générer des modèles de souris transgéniques de façon autonome. J'ai donc réalisé différentes constructions permettant d'exprimer le gène β-galactosidase sous le contrôle d'éléments potentiellement « enhancer » du promoteur ngn3. J'ai caractérisé un élément de 3,85kb permettant de diriger l'expression du gène rapporteur exclusivement dans les territoires d'expression du gène endogène ngn3. L'étude de fragment plus restreints se poursuit actuellement mais nous disposons l'un fragment de 2,2kb dirigeant en transgenèse l'expression du gène LacZ dans l'hypothalamus ventral et les épithéliums pancréatiques et intestinaux. Le second objectif de cette thèse est d'obtenir un marquage in vivo, par transfert de gène, de la population des cellules souches du pancréas endocrine exprimant ngn3 dans des explants de pancréas embryonnaires murins puis humains. En effet, nous disposons d'un système in vivo unique capable de récapituler le développement du pancréas endocrine par xénogreffe d'ébauches pancréatiques. Jai démontré, dans ce modèle expérimental, la capacité de lentivirus recombinants à infecter efficacement des cellules progénitrices du pancréas, en ciblant à l'aide de promoteurs spécifiques l'expression du gène rapporteur dans les différentes populations cellulaires qui se sont différenciées. La construction et la production d'un vecteur lentiviral assurant l'expression du gène rapporteur de la GFP (Green Fluorescent protein) sous le contrôle de l'élément de 2,2kb du promoteur du gène ngn3, permet actuellement de transduire des explants de pancréas embryonnaires murins. La transposition de ces modèles à du tissu embryonnaire humain est actuellement validée. Ce travail nous donne accès, chez l'homme, au réservoir des cellules souches du pancréas endocrine. L'amplification et la sélection de telles cellules souches constituent un défi majeur pour le développement de nouvelles thérapies du diabète de type I. La fonction proendocrine de ngn3 étant déjà clairement établie au niveau du pancréas, le troisième objectif consiste à démontrer la fonction de détermination neuronale de ce facteur dans la moelle épinière. Dans le cadre d'une fonction de détermination, l'absence de différenciation d'une population de neurones est attendue suite à l'inactivation du gène ngn3. Nous avons pu démontrer que la mutation nulle ngn3 induit l'expression ectopique du facteur de détermination Mash1 dans la région ventrale de la moelle épinière exprimant normalement ngn3, assurant ainsi, une compensation fonctionnelle. Afin d'appréhender directement la fonction de détermination de ngn3 et cela en absence de compensation, nous avons généré des souris doubles mutant nulles Mash1-Ngn3. L'analyse phénotypique des mutants perte de fonction ngn3 et Mash1/ngn3 dans la moelle épinière ventral nous a permis de démontrer la fonction de ngn3 dans la détermination du devenir neuronal. De plus nous avons, pour la première fois, établi que les neurones matures dont la différenciation est déterminée par ngn3 présentent un phénotype glutamatergique. Mots clés : Ngn3, bHLH, expression tissu-spécifique, régions régulatrices, embryons transgéniques et fondateurs, ciblage progéniteurs/souches, transfert de gène, fonctions proneurale et proendocrine
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Dates et versions

tel-00466806 , version 1 (24-03-2010)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00466806 , version 1

Citer

Aline Guerci. Etude des mécanismes impliqués dans la mise en place et le contrôle de l'expression du gène neurogénine 3 dans le système nerveux central et le pancréas.. Physiologie [q-bio.TO]. Université Paris Sud - Paris XI, 2006. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00466806⟩
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