Conséquences de l'échange de domaines évolutivement éloignés sur l'activité et la géométrie de la NADPH-cytochrome P450 réductase.
Résumé
Cytochromes P450 (P450) and NADPH-cytochrome P450 reductase (CPR) form the major mixed function oxidase system participating in the metabolism of endo- and xenobiotic compounds in mammals. CPR is a multidomain protein containing two catalytic domains bearing FMN and FAD cofactors and joined by a connecting domain. Using its two flavin cofactors and a peculiar internal electron transfer cycle from FAD to FMN, CPR is capable of splitting the dielectronic flux of NADPH to sequential electron transfers to P450. Available CPR structures evidenced a conformation with the two cofactors in tight proximity, consistent with an internal electron transfer from FAD to FMN. However this conformation state (called “closed”) is incompatible with an external transfer between CPR and P450 since the FMN cofactor is completely buried into the protein. The project of this thesis was to produce and analyze the biochemical and structural behavior of chimeric CPR composed of catalytic domains originating from yeast and human CPR. Those chimera were still functional toward artificial and natural acceptors. Moreover, we obtained the 2.5 Å resolution crystal structure of one of them in a novel open conformation. Comparison with closed structures evidences a major conformational change separating both flavin cofactors from 86 Å. This new open structure of CPR could represent a protein conformation compatible with the bimolecular electron transfer complex to P450 and reveals the dynamical nature of such a multidomain protein. Factors influencing or dictating those conformational changes were studying through steady-state and rapid kinetics, potentiometry or denaturation analysis.
Les cytochromes P450 (P450) et la NADPH-cytochrome P450 réductase (CPR) sont les principaux acteurs du métabolisme des xénobiotiques chez les mammifères. La CPR est une protéine multidomaine formée de deux domaines catalytiques comprenant les cofacteurs FAD et FMN et reliés par un domaine de connexion. Grâce aux propriétés rédox de ses deux flavines, la CPR est capable de scinder le flux diélectronique du NADPH en deux transferts monoélectroniques vers les P450. Jusqu'alors, la CPR avait toujours cristallisé dans une conformation dite fermée, compatible avec un transfert interne du FAD au FMN, mais dans laquelle le FMN était tellement enfouie au cœur de la protéine qu'un transfert externe vers les P450 était inenvisageable. Le projet de cette thèse consistait à construire et analyser les caractéristiques structurales et biochimiques de CPR chimères constituées de domaines issues des CPR humaine et de levure. Ces chimères sont toujours fonctionnelles vis-à-vis d'accepteurs artificiels et naturels. Leurss constantes catalytiques, la vitesse des différents transferts d'électrons internes et externes, les potentiels standards de leurs cofacteurs ou encore leur stabilité vis-à-vis d'agents dénturants ou de la température ont été mesurés et comparés aux caractéristiques des CPR parentales. De plus, la structure cristallographique de l'une d'elle a pu être déterminée à 2,5 Å de résolution et dans une nouvelle conformation dite ouverte. Celle-ci prouve le caractère dynamique de cette protéine multidomaine, et pourrait correspondre à la conformation de la CPR au sein du complexe bimoléculaire CPR-P450 lors du transfert externe entre le FMN et le cytochrome. Les facteurs pouvant influencer ou dicter ces changements conformationnels ont été appréhendés grâce à des analyses d'enzymologie, de cinétiques rapides, de potentiométrie ou encore de dénaturation.
Domaines
Biochimie [q-bio.BM]
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